科佰生物作為一家提供企業(yè)核酸診斷標(biāo)準(zhǔn)品的企業(yè)，在該領(lǐng)域已經(jīng)深耕多年，與全國該領(lǐng)域90%的企業(yè)都有過合作，成功支持過很多企業(yè)的試劑盒研發(fā)和獲批，在該領(lǐng)域有豐富的經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)我們對(duì)市場(chǎng)的調(diào)研，對(duì)客戶需求的理解，我們把我們的產(chǎn)品線劃分為多個(gè)模塊，主要為支持PCR的單點(diǎn)mutation、fusion和CNV產(chǎn)品，支持NGS的小panel和大panel(泛腫瘤、包含TMB和MSI)產(chǎn)品，支持IHC和Fish的FFPE block產(chǎn)品，支持標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)的dPCR檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品等。

接下來的幾期，我們陸續(xù)會(huì)針對(duì)不用的腫瘤，遵循NCCN指南的標(biāo)注，為大家分享我們對(duì)企業(yè)參考品選擇的看法。

肺癌（Lung cancer）是惡性的肺部腫瘤，肇因于肺部組織細(xì)胞不受控制地生長。如不治療，腫瘤細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)移至鄰近組織或身體的其他地方。肺部常見的原發(fā)性惡性腫瘤屬于上皮癌，可粗分為小細(xì)胞癌（SCLC）和非小細(xì)胞癌（NSCLC）。根據(jù)《2018年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)》顯示：

1. 2018年將有大約1810萬癌癥新發(fā)病例和960萬癌癥死亡病例。

2. 肺癌依舊是發(fā)病率（11.6%）和死亡率（18.4%）較高的惡性腫瘤。發(fā)病率其次為女性乳腺癌（11.6%）、前列腺癌（7.1%）、結(jié)直腸癌（6.1%）；死亡比例其次為結(jié)直腸癌（9.2%）、胃癌（8.2%）、肝癌（8.2%）。 

從中國來看，肺癌是發(fā)病率（女性為乳腺癌較高）和死亡率較高的癌癌種。

肺癌的治療一般分為外科治療、放療、化療和免疫治療，針對(duì)化療和免疫治療，臨床已經(jīng)有很多靶向藥物，包含小分子和大分子藥物，出于精準(zhǔn)診療的原則，治療前分子與生物標(biāo)志物的分析尤為重要，針對(duì)肺癌的分子標(biāo)志物主要包含EGFR，ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一個(gè)可能有助于選擇適于免疫治療患者的新型生物標(biāo)志物，目前尚無測(cè)量TMB的共識(shí))，各個(gè)分子標(biāo)志物的臨床意義和指導(dǎo)，請(qǐng)點(diǎn)擊下載NCCN指南。因此圍繞這些基因的診斷對(duì)肺癌的治療有著非常重要的作用，被廣泛應(yīng)用于臨床。

自然而然，國內(nèi)外針對(duì)肺癌開發(fā)的診斷試劑盒是熱門的，也是比較成熟的，甚至可以說作為腫瘤領(lǐng)域診斷公司的一張入場(chǎng)券，不管是已經(jīng)獲批的，還是正在申報(bào)的，甚至剛開始研發(fā)的，大家都在這個(gè)領(lǐng)域摩拳擦掌，準(zhǔn)備大干一番。

圍繞肺癌診療相關(guān)的EGFR,ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一個(gè)可能有助于選擇適于免疫治療患者的新型生物標(biāo)志物，目前尚無測(cè)量TMB的共識(shí))，我們依次分析各個(gè)基因在診療中的選擇。

分子標(biāo)志物：EGFR

?表皮生長因子受體(EGFR)基因突變: EGFR 是一種常見于上皮細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶，在多種人類惡性腫瘤中往往呈過表達(dá)。

EGFR中常見的突變(外顯子19缺失,外顯子21中p.L858R點(diǎn)突變)與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療的應(yīng)答情況相關(guān);近期的資料表明未攜帶EGFR敏感突變的腫瘤不應(yīng)在任何時(shí)段的治療中接受EGFR TKI的治療。

²一些少見的EGFR突變,這類突變累計(jì)占到EGFR突變非小細(xì)胞肺癌的近10% (例如，外顯子19插入，p.L861Q、 p.G719X、p.S768I) 也與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI) 治療的應(yīng)答情況相關(guān)，但所研究的患者數(shù)目較少。

²一些EGFR突變與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI) 治療的應(yīng)答情況缺乏相關(guān)性，包括大多數(shù)EGFR外顯子20插入，以及p.T790M。

-大多數(shù)EGFR外顯子20插入突變預(yù)示著對(duì)臨床可達(dá)到的酪氨酸激酶抑制劑治療(TKI) 水平的抵抗(耐藥)。

-例外情況是一種罕見的EGFR外顯子20插入變異型，p.A763_ Y764insFQEA,其與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI) 治療的應(yīng)答情況相關(guān)。因此,對(duì)EGFR外顯子20插入的認(rèn)識(shí)必須建立在特定基因序列變異的基礎(chǔ)上。

-與EGFR TKI初始治療后疾病復(fù)發(fā)常見的相關(guān)發(fā)現(xiàn)是p.T790M突變,這是已知的耐藥機(jī)制。如果在TKI暴露前發(fā)現(xiàn)該突變,則應(yīng)考慮行遺傳咨詢，因?yàn)榉N系p.T790M突變與家族性肺癌易感性有關(guān)，故需要額外的檢測(cè)。

²隨著高通量測(cè)序(NGS)檢測(cè)使用的增加，其它EGFR變異型的檢出率也在增高;但是，個(gè)體變異的臨床意義不易明確。

²某些臨床病理特征——諸如吸煙情況、 種族和組織學(xué)特征——均與某種EGFR突變的存在情況相關(guān);不過，這些特征不應(yīng)用于選擇接受檢測(cè)的患者。

²檢測(cè)方法:實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、 桑格(Sanger)測(cè)序法(配合腫瘤富集操作)，以及高通量測(cè)序法(NGS) 是檢測(cè)EGFR突變狀態(tài)的常用的方法。

分子標(biāo)志物：ALK

?簡變性淋巴瘤激酶(ALK) 基因重排: ALK 是非小細(xì)胞肺癌中一種可被重排的受體酪氨酸激酶，重排導(dǎo)致通過ALK激酶結(jié)構(gòu)域的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)和異常。

²ALK常見的融合對(duì)象是棘皮動(dòng)物微管相關(guān)樣蛋白4 (EML4),但其它多種融合對(duì)象也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。

²ALK重排的存在與對(duì)ALK酪氨酸激酶抑制劑治療(TKI)的應(yīng)答情況相關(guān),近期研究顯示在一線治療中阿來替尼(Alectinib) 比克唑替尼(Crizotinib) 的療效更佳。

²某些臨床病理特征——諸如吸煙情況和組織學(xué)特征已被證實(shí)與某種ALK重排的存在情況相關(guān);不過，這些特征不應(yīng)用于選擇接受檢測(cè)的患者。

²檢測(cè)方法:熒光原位雜交(FISH)分離探針法是一個(gè)廣泛使用的方法。免疫組化法可作為一種有效的篩查手段使用。經(jīng)FDA批準(zhǔn)的免疫組化法(ALK[D5F3]CDx檢測(cè))可單獨(dú)使用，無需經(jīng)FISH確認(rèn)結(jié)果，但鼓勵(lì)對(duì)結(jié)果行二次確認(rèn)。多種高通量測(cè)序(NGS)法可檢測(cè)ALK融合突變,而有時(shí)會(huì)用到靶向?qū)崟r(shí)多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè),不過它們均不太可能檢出帶有新的融合對(duì)象的突變。

分子標(biāo)志物：ROS1

?ROS1 (ROS原癌基因1)基因重排: ROS1是非小細(xì)胞肺癌中一種可被重排的受體酪氨酸激酶,重排導(dǎo)致通過ROS1激酶結(jié)構(gòu)域的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)和異常。

²發(fā)現(xiàn)的ROS1融合對(duì)象有多種，常見的融合對(duì)象包括: CD74、 SLC34A2、 CCDC6 和FIG。

²ROS1重排的存在與口服ROS1酪氨酸激酶抑制劑(TKI)療效相關(guān)。

²某些臨床病理特征——諸如吸煙情況和組織學(xué)特征——已被證實(shí)與某種ROS1 重排的存在情況相關(guān):不過，這些特征不應(yīng)用于選擇接受檢測(cè)的患者。

²檢測(cè)方法:熒光原位雜交(FISH)分離探針法可以使用:不過,其可能無法檢測(cè)FIG-ROS1變異型。免疫組化法(IHC)可以使用;不過,針對(duì)ROS1融合突變的IHC檢測(cè)敏感性低，而隨訪驗(yàn)證性檢驗(yàn)是作為一種篩查手段使用的ROS1 IHC法*的一部分。多種高通量測(cè)序(NGS)法可檢測(cè)ROS1融合突變,而有時(shí)會(huì)用到靶向?qū)崟r(shí)多聚酶鏈反應(yīng)(PCR) 檢測(cè)，不過它們均不太可能檢出帶有新的融合對(duì)象的突變(這樣會(huì)導(dǎo)致無法檢出ROS1融合事件)。

分子標(biāo)志物：BRAF

?BRAF (B-Raf原癌基因)點(diǎn)突變：BRAF是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,屬于經(jīng)典的MAP/ERK信號(hào)通路的一部分。BRAF突變激活導(dǎo)致通過MAP/ERK路徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)。

²BRAF突變可見于非小細(xì)胞肺癌。導(dǎo)致氨基酸位點(diǎn)600發(fā)生變化(p.V600E)的某種特定突變的存在已被證實(shí)與口服型BRAF和MEK抑制劑聯(lián)合治療的效果(應(yīng)答情況)相關(guān)。

²注意其它BRAF突變已在非小細(xì)胞肺癌中被觀察到，而目前這些突變對(duì)于治療選擇的影響尚未明確。

²檢測(cè)方法:實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、桑格(Sanger) 測(cè)序法(配合腫瘤富集操作)，以及高通測(cè)序法(NGS)是檢測(cè)BRAF突變狀態(tài)的常用的方法。盡管一種抗-BRAF p.V600E-特異性單克隆抗體已投入商用，而且一些研究已經(jīng)測(cè)評(píng)了該方法的應(yīng)用情況，但只有在大規(guī)模驗(yàn)證后才應(yīng)該使用該方法。

分子標(biāo)志物：KRAS

?KRAS (KRAS原癌基因)點(diǎn)突變: KRAS是一種具有內(nèi)在GTP酶活性的G蛋白，而激活突變導(dǎo)致通過MAP/ERK路徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)。

²KRAS突變常見于密碼子12,但其它突變類型也可在非小細(xì)胞肺癌中見到。

²當(dāng)與無KRAS突變的腫瘤患者相比，KRAS突變的存在預(yù)示生存不良。

²KRAS 突變已被證實(shí)與EGFR TKI治療的效果(應(yīng)答情況)降低相關(guān)。

²由于變異靶點(diǎn)的重疊可能性小，故KRAS突變的存在可能表明患者將不會(huì)從進(jìn)一步的分子檢測(cè)中獲益。

分子標(biāo)志物：其他

·靶向治療中疾病進(jìn)展時(shí)的檢測(cè):

?受惠于上文列舉的多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)，對(duì)治療耐藥的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)也隨之增加。當(dāng)靶向治療中疾病活動(dòng)性進(jìn)展時(shí)，對(duì)標(biāo)本重新檢測(cè)可為下一步治療提供線索:

²對(duì)于已經(jīng)EGFR TKI治療，攜帶有潛在的EGFR敏感突變的患者，適宜的檢測(cè)項(xiàng)目起碼包括p.790M的高敏評(píng)估:當(dāng)沒有p.T790M存在證據(jù)時(shí)，針對(duì)替代性耐藥機(jī)制(MET擴(kuò)增、ERBB2擴(kuò)增)的檢測(cè)可被用來指導(dǎo)患者的其它治療。p.T790M 的存在可指示患者接受第三代EGFR TKI治療。

-檢測(cè)EGFR p.T790M的試驗(yàn)設(shè)計(jì)的分析敏度應(yīng)至少達(dá)到5%等位基因分?jǐn)?shù)。早期的敏感突變可被用作許多試驗(yàn)中的一種內(nèi)部對(duì)照以確定如果作為亞克隆事件存在的話，p.T790M 是否處于檢測(cè)范圍內(nèi)。

²對(duì)于已經(jīng)ALK TKI治療的攜帶有潛在ALK重排突變的患者,還不清楚發(fā)現(xiàn)特定的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變是否能確定合理的下一步治療,但一些初步數(shù)據(jù)提示特定的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變能影響后續(xù)治療。

其中涉及的基因有MET skiping、MET擴(kuò)增、RET重排和ERBB2擴(kuò)增。

分子標(biāo)志物：panel

對(duì)于PCR的企業(yè)參考品，如上的位點(diǎn)基本全部滿足了，那針對(duì)NGS的panel型參考品，我們需要把重要的位點(diǎn)一起檢測(cè)，這就要要求混樣，混樣有一定的原則，根據(jù)混樣的原則和市場(chǎng)需求，我們開發(fā)了一些參考盤，具體如下：

綜上，按照NCCN的指南，按照臨床的藥物，按照伴隨診斷的需求，科佰生物開發(fā)了針對(duì)肺癌PCR的單點(diǎn)參考品、標(biāo)準(zhǔn)品，針對(duì)肺癌NGS的panel型的參考品、標(biāo)準(zhǔn)品，滿足不同客戶的需求。

標(biāo)準(zhǔn)品選擇好了，接下來就是做性能評(píng)價(jià)，讓我們先學(xué)習(xí)下指導(dǎo)原則，對(duì)于性能評(píng)價(jià)的規(guī)定。詳見《從《指導(dǎo)原則》中分析參考品盤設(shè)計(jì)》。